大鼠白細胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒 （酶聯(lián)免疫法）操作步驟

線性范圍：1.25-80 pg/mL

1. 預(yù)期用途

本試劑盒用于檢測血清、血漿等樣本中大鼠白細胞介素-6（IL-6）濃度，僅供研究使用。

2. 檢測原理 

試劑盒采用雙抗體夾心法原理：將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及校準(zhǔn)品中待測物，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，結(jié)合形成“抗體-抗原-抗體-HRP"免疫復(fù)合物，加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中待測物的濃度。

3. 包含的實驗材料實驗材料

如需單獨采購通用型組分，請?zhí)峁?yīng)的組分名稱。

4. 需要但未包含的實驗材料

· 蒸餾水或去離子水，一次性離心管、一次性手套等耗材；

· 移液器、多通道移液器及配套槍頭；

· 燒杯、量筒、試劑瓶等容器具；

· 用于封貼微孔板的封板膜或其他替代材料；

· 微孔板振蕩器（如有需要）、離心機、旋渦振蕩器等輔助設(shè)備；

· 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、酶標(biāo)儀、洗板機。

5. 試劑的準(zhǔn)備及儲存

· 1×洗液的配制：濃縮洗液（20×）如有晶體析出，需在37℃下加熱至晶體全部溶解后使用。用蒸餾水1:20稀釋，例如：10mL濃縮洗滌液加入190mL的蒸餾水，混合均勻。

1×通用稀釋液的配制：用蒸餾水1:20稀釋，例如：10mL的20×濃縮通用稀釋液加入190mL的蒸餾水，混合均勻。

1×酶標(biāo)記物工作液的配制：100×酶標(biāo)抗體用“1×通用稀釋液"按1:100倍稀釋，例如：10uL的（100×）酶標(biāo)抗體加入990uL的“1×通用稀釋液"，混合均勻。配制好的1×酶標(biāo)抗體工作液可以在2~8℃保存8h。

· 工作校準(zhǔn)品的配制：校準(zhǔn)品開封前應(yīng)離心30秒，確保所有校準(zhǔn)品集中于底部；

準(zhǔn)備7個離心管，將10×校準(zhǔn)品按需吸取一定量用“1×通用稀釋液"稀釋10倍配制成校準(zhǔn)品S1。例：50uL的10×校準(zhǔn)品+450uL的“1×通用稀釋液"，制備得到500μL的S1濃度校準(zhǔn)品。在隨后的6個離心管中分別加入250μL的“1×通用稀釋液"，在這6個試管中（S2~S7）將S1校準(zhǔn)品依次倍比稀釋6個梯度至S7，共配制7個濃度的校準(zhǔn)品，依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，如下圖所示。“1×通用稀釋液"作為空白校準(zhǔn)品S0。

6. 樣品采集、預(yù)處理及儲存

· 血清：使用血清采集管采集全血，室溫靜置待血細胞凝集后取的血清，或直接在1000×g下離心15分鐘取得血清。操作應(yīng)柔和，避免溶血發(fā)生。獲取的血清應(yīng)及時進行檢測，如不能及時進行檢測，應(yīng)等分為多份，儲存在-20℃及以下溫度條件，儲存時間不超過6個月，樣品凍融不超過2次。

· 血漿：使用EDTA或肝素采血管收集血漿。全血采集后以1000×g離心15分鐘取得血漿。操作應(yīng)柔和，避免溶血發(fā)生。獲取的血漿應(yīng)及時進行檢測，如不能及時進行檢測，應(yīng)等分為多份，儲存在-20℃及以下溫度條件，儲存時間不超過6個月，樣品凍融不超過2次。

· 組織：組織稱重后剪碎，將剪碎的組織加入裂解液，一般按1:4-1:9的重量體積比，比如100mg的組織樣品對應(yīng)400uL的裂解液，具體可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。

· 細胞：取適量細胞，于冰上進行超聲破碎，5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。

· 細胞上清：取細胞上清于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。

7. 實驗步驟

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右，也可置于37℃溫箱快速回溫至室溫。

注意：酶標(biāo)板未恢復(fù)室溫前，請勿開封。

* 樣品稀釋液50uL，加樣品50uL樣品稀釋倍數(shù)為2倍。

* 樣品稀釋液80uL，加樣品20uL，則稀釋倍數(shù)為5倍。

* 如樣本珍貴量少，可適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)，應(yīng)當(dāng)進行預(yù)實驗確定最佳稀釋倍數(shù)。

8. 結(jié)果計算

雙波長檢測結(jié)果無需進行調(diào)0，可直接進行標(biāo)曲擬合及結(jié)果計算。

以下曲線擬合方式均可使用，選擇擬合后r值的擬合方式進行結(jié)果計算。

l 四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合：以濃度值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)；

l 多項式曲線擬合：2次多項式、3次多項式；

l 雙對數(shù)直線擬合：以濃度值取對數(shù)，吸光度值取對數(shù)后，進行直線擬合；

l 點對點擬合：各相鄰點之間分別單獨進行線性擬合，分段計算；

推薦使用專業(yè)化軟件進行結(jié)果擬合和計算，如ELISACALC、SPSS、Graphpad Prism等。

**最終樣本濃度應(yīng)乘上樣本的稀釋倍數(shù)。

曲線擬合方式示例圖，以下數(shù)據(jù)和曲線僅供示例，與本試劑盒測定結(jié)果無關(guān)。

9. 檢測的局限性

樣本濃度超出檢測范圍上，應(yīng)當(dāng)進行適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)后再次檢測，計算結(jié)果應(yīng)當(dāng)乘上稀釋倍數(shù)。樣本濃度低于LOQ定量，檢測結(jié)果無法進行準(zhǔn)確定量。

10. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

以下結(jié)果基于校準(zhǔn)品的濃度值實驗得出，未納入基質(zhì)效應(yīng)等其他因素的潛在影響。

靈敏度：1.06 pg/mL

精密度：板內(nèi)精密度CV＜10%（N=20），板間精密度CV＜15%（N=20）。

特異性（Analytical specificity）：其他相關(guān)因子在稀釋緩沖液中制備為10μg/mL測定，沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。